酶活性测定的原理是什么

酶活性测定的原理是什么

酶活性测定的原理：

1. 超氧物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）

   活性的测定 SOD采用氮蓝四唑（nitro-bluetetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）。反应步骤为：取200μl粗提液，加入3.7 ml NBT反应液50mmol/LpH7.8的磷酸缓冲液（PBS）配制的含77.12μmol/L氮蓝四唑,100μmol/LEDTA－Na2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液〕，在30℃下保温2分钟后加入100μl核黄素溶液（pH7.8的50mmol/L磷酸缓冲液中含80.2μmol/L 核黄素和100μmol/LEDTA－Na2），在4000Lx日光下反应20min。然后迅速测定A560。以不照光的管做空白。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。酶活性按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50％为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表示。以加缓冲液代替酶液的作为对照。

   SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 式中， Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样品鲜重（g）或蛋白质含量（mg）。

2. 过氧化氢酶（Catalase，CAT）

   活性测定 CAT 活性参照Aebi(1984)[7]的方法进行测定。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL 。400 μL反应液含50mmol/L的PBS(pH7.0)，30mmol/L的H2O2和50µL粗酶液。反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240nm吸光度的降低值。酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25℃，pH7.0条件下1分钟分解1μmol过氧化氢所需酶量，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。

3. 多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）

   活性的测定 PPO活性测定采用邻苯二酚法（Aquino-Bolaños和Mercado-Silva，2004）。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。350µL反应液（用50mmol/L，pH6.4的PBS配制，内含100µmol/L邻苯二酚）中加入50µL的粗酶液，平衡1分钟后连续测定398nm吸光度的变化。以1分钟内398nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。

4. 过氧化物酶（Peroxidase，POD）

   活性测定POD活性测定采用愈创木酚法（Lurie等，1997)。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。反应体系为30μL粗酶液，290µL0.3%愈创木酚（用50mmol/L的PBS配制，pH6.4）和 80µL0.3%H2O2（用50mmol/L的PBS配制，pH6.4）。反应在加入H2O2 后开始准确记时。连续吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分钟上升0.01为一个单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。

酶特性的检验原理

酶活性测定法是利用酶能专一而高效地催化化学反应的性质，通过测定酶促反应速度来检知体液等生物样品中某种酶的含量和活性的分析技术。

酶活力的测定可采用两种方式：

其一是测定完成一定量反应所需的时间，其二是测定单位时间内的酶催化的化学反应量。

终点法

该方式是在特定条件下，将样品中要检知的酶作用一定量的底物，然后根据反应进行到某一程度(即达到某一指标)所需要的时间长短来估计酶的活力。

其一个发展是采用检测器对反应进行连续跟踪，并在反应达到某一程度时，精确地自动记录所需要的时间，这就是酶分析自动化中的固定浓度法；另一个发展是作成简便的酶检测纸片。

动力学法

该方式测定原理是：在一定条件下，酶促反应速度和酶浓度成正比，因此测得反应速度就需要求得酶浓度。待测的酶浓度是影响反应速度的唯一因素，其他因素都应处于最适于酶发挥催化作用的水平，为此应选择适宜的底物浓度、缓冲体系、温度，并向反应系统中添加必要的辅助因子。

双乙酰检测酶活力的原理

原理:酶活力测定的原理是利用了没能专一高效的催化化学反应的性质，通过鉴定没反应，速度来判断体验等生物标本检测。 酶活力鉴定属于一种某种物理方法测定化合物，通过检测以后，能够查看出酶反应的过程中变化的程度来测定反应情况，然后进行酶活力的分析，能够判断身体是否出现异常变化，这种酶活性鉴定主要用于肝胆科进行检测身体的酶活量，来判断转氨酶高低的情况。

2.为什么临床生化检测中采用酶活检测来反映酶含量?

临床生化检测中采用酶活检测来反映酶含量的原因主要包括以下几方面： 1. 酶活性可以反映酶的活性状态：酶是一种能够促进生物化学反应的催化剂，对生物体内代谢有决定性影响。酶的活性取决于其结构和物理化学环境，如温度、pH、离子强度等。因此通过检测酶活性可以了解酶在生理状态下的活性程度。 2. 酶活性可以反映酶的特异性：酶在催化反应时，与特定的底物结合，从而使反应快速进行。不同酶对应的底物一般是特异性的，因此检测酶活性也可以为其所对应的底物提供依据，并反映其在代谢通路中的位置。 3. 酶活性可以反映酶的数量：酶活性与酶的数量之间存在一定的相关性。在正常情况下，酶活性与酶含量成正比。因此通过检测酶活性也

为什么要测酶活力

酶活力（enzyme activity）也称为酶活性， 测量酶活力的原因：测定酶催化一定化学反应的能力。 酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适.