同一根柱子杂质变小，换根色谱柱正常了

同一根色谱柱，在不同的色谱仪器上，采用相同的色谱条件，但是杂质的分离度差异太大，比如A和B两种物质

如果其他条件完全相同，也就是你所说的死体积的问题。管路上都差不多，主要是检测池的问题。如果仪器1检测池较小，进样量比较小的话，会有你说的完全分离的情况。而换成了仪器2，检测池较大，会出现样品分散的情况，导致分不开。

有谁知道色谱柱坏了，然后我把它倒过来用了大概半个月，这根色谱柱还有用吗？还能填充料吗？

首先从你所说的坏了，倒过来用大概半个月来判断，应该是倒过来之后的效果你还能接受并且一直在这么用。 由此推测，你所说的坏了可能是柱头塌陷导致峰型扩散，倒用之后峰型改善；或者是杂质堵塞柱头，倒用之后杂质被冲出色谱柱。 一般来说，色谱柱倒用可能导致床层断裂，从而彻底坏掉。所以，趁着现在柱子还没坏之前，降低你的流速到正常流速的1/10，并长时间冲洗色谱柱（20-30h），之后再正用，可能还能解决之前峰型扩散的问题。 或者，干脆打开柱头补上一点填料，还能修补到之前70%左右的柱效。

两种不同的流动相用同一根色谱柱对色谱柱有什么影响

这主要看色谱的使用说明。 比如通常的C18色谱柱来说，只要PH在2-8的有机相和水相就可以做为流动相使用。在使用过程中主要是注意一方面在极性差别大一些流动相替换时，要防止互溶性不好的问题，有时用缓冲盐，直接换成极性非常弱的流动相时防止盐析现象。还有，就是防止机械杂质堵柱子的问题。 至于用什么样的流动相，只要符合柱子说明书的流动相，都 可以使用，相互替换使用也没关系 。

液相更换色谱柱要注意那些事项?

（1）如果更换色谱柱涉及到不同分离模式（正相、反相、离子对、离子交换等）之间的转换，要注意不同色谱柱类型之间的流动相体系的相溶性。具体见本书其它相关内容。 （2）换柱前，先确认仪器上现有的色谱柱已经冲洗干净，且柱内流动相适合保存色谱柱。然后停泵，拆下旧柱，注意将封口螺丝拧好。 （3）在接新柱时，最好出口端先不接检测器。设定一个小流速，注意柱子的流向，不能接反（除非特意）。观察流动相流出色谱柱后柱压的变化。一定要注意流动相应与仪器系统中原来的流动相互溶。 （4）估计柱内保存液基本流出色谱柱，且柱压基本稳定后再接上检测器，这样既可排净保存液，也排出了可能会留在柱中的气泡。连接管线的接头螺丝一定要拧

色谱柱的注意事项

色谱柱 的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。
①　避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。
②　应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。
③　一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
④　选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
⑤　避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。
⑥　经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50~75ml。
下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100~200μl四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染。
阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、水依次冲洗。
⑦　保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。
⑧　色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。
在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。
柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。
通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH2~9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。
每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4~5天开机冲洗15分钟。