为什么核酸分离后要鉴定纯度

为什么用OD260/OD280评定核酸纯度

核酸的最大吸收波长是260nm，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。

在波长260nm紫外线下，1 OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；寡核苷酸为20μg/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。

通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）可以估计核酸的纯度。纯DNA的比值为1.8，纯RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。样品中如混有RNA比值上升。

扩展资料

显示DNA的传统方法是富尔根（Feulgen）反应，切片先用稀盐酸处理，DNA经弱酸（1mol/L HCL）水解后，在60℃条件下使DNA分子中脱氧核糖与嘌呤之间的连接打开，脱氧核糖的一端释放出醛基，并在原位与Schiff试剂反应生成紫红色产物。

原理同PAS反应，使细胞核DNA显紫红色。在此过程中RNA不受影响，故染色具有DNA特异性。准确的温度和盐酸浓度，适宜的水解时间是成功的关键。水解过度或不足均降低染色强度。

核酸可分为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）。

核酸不但是一切生物细胞的基本成分，还对生物体的生长、发育、繁殖、遗传及变异等重大生命现象起主宰作用。它在生物科学的地位，可用“没有核酸就没有生命”这句话来概括。

参考资料来源：百度百科-核酸

参考资料来源：百度百科-核酸显示法

参考资料来源：百度百科-OD260/280比值

酵母核糖核酸的分离和鉴定。实验原理

一、 实验目的

1、掌握酵母RNA提取的方法。

2、了解核酸的组成。

3、掌握鉴定核酸组分的方法和操作。

二、 实验原理

酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到RNA制品。但是用碱液提取的RNA有不同的降解。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等组分，加入硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在(见实验内容)

三、 实验步骤

1、 用托盘天平称1g干酵母于研钵中，加入少许石英砂，再加入2ml 0.04mol/LNaOH溶液，在研钵中充分研磨至少5min。

2、 再加4ml 0.04mol/LNaOH溶液于匀浆液中，混匀后，将匀浆液转移到大试管中，再用4ml 0.04mol/LNaOH溶液洗涤研钵，洗涤液并入匀浆液中。

3、 将大试管小心在沸水浴中加热30min，冷却后倒入离心管中，与另一组同学的离心管在托盘天平上平衡，然后两组的离心管对称地放入离心机中，2000r/min下离心15min。

4、 吸取10ml酸性乙醇溶液于小烧杯中，将离心管上清液小心倒入小烧杯中，边倒入边搅拌，直到RNA沉淀完全。

5、 将小烧杯中的液体倒入2个干净的离心管，平衡、离心（2000r/min）3min。

6、 弃去两离心管上清液，各离心管中加入95%乙醇2.5ml，振荡、混匀、平衡、离心（2000r/min）3min。

7、 弃去两离心管上清液，各离心管加入3ml 1.5mol/L硫酸，混匀、倒入同一个大试管中，贴上标签，放在试管架上，备用。

8、 将水解液在沸水浴中加热至少10min，使沉淀RNA充分水解。

9、 取一支试管A，加入1ml 0.1mol/L硝酸银溶液，再逐滴加入浓氨水至沉淀消失，然后加入1ml水解液放置片刻，观察有无白色嘌呤碱的银化合物沉淀。

10、 另取一支试管B，加入水解液1ml，三氯化铁浓盐酸溶液2ml和地衣酚乙醇溶液0.2ml（约4滴），混匀，用试管夹夹好后放到沸水浴中3~5min，注意观察溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。

11、 再取一支试管C，加入水解液1ml和定磷试剂1ml，混匀，在沸水浴中加热，注意观察溶液颜色的变化，溶液变蓝，说明磷酸存在。

注意事项：离心一定要平衡对称放入离心机中，离心机达到设置转速时才能离开。

四、 实验结果

第6步中离心管底部有不少的RNA沉淀。

试管A：出现白色浑浊现象。有嘌呤碱存在。

试管B：加热后，出现鲜绿色，且随着加热时间延长，颜色越来越深。有核糖存在。

试管C：加热后，出现蓝色，且随着加热时间延长，颜色越来越深。有磷酸存在。

说明RNA的组分中有嘌呤碱、核糖、磷酸。

分析：

本实验选用酵母，是因为酵母中RNA含量较多，且价格便宜。RNA可溶于碱性溶液，所以本实验用0.04mol/LNaOH溶液来提取。RNA不溶于乙醇，可用酸性乙醇使RNA从溶液中沉淀出来，再用乙醇洗涤沉淀，可得到RNA粗制品。

研磨和NaOH使酵母细胞破裂，RNA主要存在于细胞质中，所以RNA被释放出来，同时，NaOH使蛋白质变性。

加入酸性乙醇，一方面可以中和NaOH，另一方面，使RNA从溶液中沉淀下来。

RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等组分，加入硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。

（1）、强酸使核酸分子的有机磷消化为无机磷，使之与钼酸铵结合成磷钼酸铵（黄色沉淀）
PO43- + 3NH4+ + 12MoO42- + 24H+ ===(NH4)3PO4.12MoO3.6H2O + 6H2O

当有还原剂（如维生素C）存在时，Mo6+被还原成Mo4+，再与试剂中的其它MoO42-结合成Mo（MoO4）2，呈蓝色，称钼蓝。所以试管C中会出现蓝色。

（2）、RNA与硫酸共热，生成的核糖进而脱水转化为糠醛，三氯化铁作为催化剂，可与地衣酚反应，生成绿色化合物，所以试管B中出现绿色。（OR苔黑酚）

（3）、嘌呤碱可与硝酸银反应产生白色的飘零银化合物沉淀。所以试管A中出现浑浊现象。

（4）、不检测嘧啶碱，是因为与嘌呤碱相比，它难以被水解下来，同时它难检测且现象不明显。

扩展资料：

酵母核酸提取原理

提取和制备RNA 的首要问题是选RNA 含量高的材料。微生物是工业上大量生产核酸的原料，其中RNA 的提制以酵母最为理想，因为酵母核酸中主要是RNA（2.67～10.0%），DNA 很少（0.03～0.516%），而且菌体容易收集，RNA 也易于分离。

RNA 提制过程首先要使RNA 从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，将pH 调至2.0～2.5，使RNA 沉淀，进行离心收集。然后运用RNA 不溶于有机溶剂乙醇的特性，以乙醇洗涤RNA 沉淀。

提取RNA 的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。浓盐法是在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的透性，使RNA 释放出来，此法易掌握，产品颜色较好。

使用浓盐法提出RNA 时应注意掌握温度，避免在20～70℃之间停留时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用的温度范围，会使RNA 因降解而降低提取率。在90～100℃条件下加热可使蛋白质变性，破坏磷酸二酯酶和磷酸单酯酶，有利于RNA 的提取。

参考资料：百度百科—酵母核酸

核酸分离提取的原则是什么？

核酸分离提取的原则 核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些嗜菌体DNA有时为单链环状分子，RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子，不同类型的RNA分子可以具有不同的结构特点，如真核mRNA分子多数在3’端带有poly(A)结构，至于病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状及单链线状等。 95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。RNA分子则主要存在于细胞质中，约占75%，另有10

如何判断提取质粒DNA的纯度

可以通过紫外吸收检测。

因为核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，单链寡核苷酸的含量为30μg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm得OD值的比值，估计核酸的纯度。

纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。若比值高于1.8说明DNA样品中的RNA尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。

270nm存在高吸收表明有酚的干扰。 紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。

扩展资料：

在判断过程中，也有可能出现质粒DNA提取纯度失败的情况，具体可能是有以下几个原因：

1、菌体量可能过大,裂解不充分,或裂解液与中和液比例不适当；

2、混合时过于剧烈,可能会带来基因组DNA片段的污染；

3、Rnase失活,可能带来RNA污染；

4、离心不充分（有絮状物在上层）,或在离心后吸取上清时,将沉淀吸入,会带来蛋白质污染.

参考资料来源：百度百科——质粒DNA纯化

核酸在分离与纯化 时，需要用那些物质？其作用是什么？

1 加入浓盐溶液（如NaCl） 核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚； 2 加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能； 3 酚/氯仿抽提 酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。