目前在使用遗传图谱和物理图谱的研究中使用哪些分子标记

分子标记技术在甜瓜上的应用有哪些？

分子标记是以生物体的遗传物质——DNA的多态性为基础的遗传标记。目前，广泛应用的分子标记技术主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SCAR、ISSR等。这些标记已广泛应用于甜瓜遗传育种研究的诸多领域，包括遗传图谱构建、遗传多样性分析、种和品种起源、分类和进化、基因定位、构建品种指纹图谱、品种或杂种纯度的鉴定、辅助育种、追踪遗传物质在杂种后代中的遗传动态，质量和数量性状基因位点分析等多个方面，显示了巨大的应用潜力。

（一）品种亲缘关系分析与分类

长期以来，甜瓜品种亲缘关系分析与分类的依据主要采用形态指标，而形态指标易受环境影响发生变异，进而影响亲缘关系判断与分类地位确定的准确性。对于一些形态指标相近或形态标记很少的品种（类型）则难以区分。应用分子标记技术可以在大范围内对甜瓜的遗传物质进行较全面的比较，包括对DNA非编码区域出现变异的检测与鉴定，比传统方法能更全面地反应其遗传多样性，为分类提供分子水平的客观依据。Neuhausen等（1992）利用RFLP技术进行甜瓜种（Cucumis melo L.）的遗传多样性研究。在分子水平上对44份材料进行分类，但在muskmelon与honeydew两个类型中的多态性分子标记较少。许勇（1999）利用RAPD技术进行了甜瓜的起源和分类研究，结果支持“多源论”，同时分子标记的聚类结果也支持了网纹甜瓜可单独划分为厚皮甜瓜的一个变种的结论。刘万勃等（2002）用ISSR和RAPD两种分子标记技术对37份甜瓜（Cucumis melo L.）的遗传多样性进行了研究，根据两种标记的结果，将供试材料分为两大类：野生甜瓜和栽培甜瓜。两种分子标记的分析结果均呈极显著正相关（r=0.62＞r=0.01）。各野生甜瓜种质之间的遗传距离较大，这与其分类地位基本一致。从已有的甜瓜分子标记研究来看，甜瓜品种间的分子标记的多态性高于西瓜，这与甜瓜复杂的遗传基础是一致的。金基石（2001）等用RAPD技术对22份薄皮甜瓜材料分析结果与这一结果一致。

必须指出，分子标记技术对甜瓜品种亲缘关系分析与分类的准确性和可靠性，依赖于使用材料的代表性和分子标记对基因组探测的深入程度，同时，还必须与形态分析相结合。只有这样才能获得更全面、更科学的结果。

（二）一代杂种纯度的鉴定

用DNA标记技术鉴定一代杂种纯度的基本原理，就是以目标品种DNA图谱中某一DNA特异谱带的出现与否加以判断。即要求选择目标品种的DNA图谱中出现而其他品种中不出现的DNA谱带作为鉴定其纯度的特异谱带，通过比较F1代与双亲的特征谱带，就可能实现杂种纯度的室内快速鉴定。陆璐等（2005）用SSR标记技术对2个甜瓜杂交品种（系）东方蜜1号和01-31及其亲本进行了鉴定，从23对SSR引物中筛选出8对引物能分别在2个甜瓜杂交种和其双亲之间扩增出多态性。表现为每个杂交组合的父本和母本分别扩增出一条各自的特征带，而其杂交种则出现双亲的两条特征带，表现为双亲的互补带型，因此可以准确区分真假杂种。其后分别用SSR引物M6和M18对东方蜜1号和01-31进行了各100粒种子的纯度鉴定，所测得的杂交率与田间种植鉴定结果完全相符。表明SSR标记技术可以应用于甜瓜一代杂种纯度的室内快速检测。

分子标记技术在作物品种鉴定中的应用研究，无论从理论上或实践上都很有价值。根据各品种指纹图谱的差异程度，可判断品种间亲缘关系的远近。测量品种间遗传距离的远近并进行系谱分析，能指导科学的配制杂交组合，减少育种的盲目性。同时，品种指纹图谱高度的个体特异性，甚至可以检测到基因组中的微小变异，符合品种鉴别技术应具备的环境的稳定性，品种间变异的可识别性，最小的品种内变异及实验结果的可靠性的基本准则，相对于早期的形态学标记鉴定具有简便迅速等优点。此外，对于保护名、优、特种质及育成品种的知识产权和维护育种工作者的权益等均有重要意义。但从总体上来讲，这些研究成果还处于积累阶段，离实际应用还有距离，因此仍有待更深入细致地研究。

（三）甜瓜遗传图谱构建与相关基因的标记与定位

构建甜瓜分子遗传图谱，极大地方便了甜瓜育种研究工作，也为相关基因的分离克隆奠定了基础。目前，利用分子标记已经构建了一些甜瓜品种的遗传图谱，对一些抗病基因或与其紧密连锁的分子标记在相应的图谱中进行了定位。1996年，Baudracco-Arnas 和Pitrat运用AFLP、RAPD技术建立了甜瓜遗传图谱。2002年Anin-Poleg等构建了甜瓜P1414723的遗传图谱，并将西葫芦黄化花叶病毒ZYMV的抗性基因定位于该图谱中。2003年Silberstein等用RAPD、SSRs、AFLP技术建立了甜瓜（P1414723）基因连锁图谱，该图谱包含了蚜虫抗性表型、性别性状表型及种皮顔色表型的相关基因的分子标记。Wechter等（1995）在甜瓜抗病材料MR-1上获得了与抗枯萎病生理小种1连锁的RAPD标记，并成功地将其转化为SCAR标记。2000年Wang等用MR-1和感病品种AY杂交建立了F2代分离群体，利用AFLP和RAPD技术，得到了与甜瓜抗枯萎病生理小种0和1的抗性基因Fom-2连锁的15个分子标记，并将Fom-2基因定位于MR-1K。Zheng等（2001）也报道了与甜瓜枯萎病抗性基因Fom-2位点连锁的3个RAPD标记E07、G17和G596。其中E07和G17是感病状态连锁标记，而且存在于很多感病品种中。最近，Yael等（2002）找到与甜瓜抗ZYMV病毒基因Zym-1紧密连锁的SSR标记CMAG36，遗传距离为9.1cM；与甜瓜抗枯萎病生理小种0和2抗性基因Fom-1连锁的SSR标记CMTC47，遗传距离为17.0cM。

除了对甜瓜抗病基因标记外，也开展了对其他一些控制甜瓜重要性状基因标记的研究。李秀秀（2004）通过对甜瓜雄花两性花同株与雌雄异花同株材料间杂交后代，及回交后代的花性型分离研究表明：F2群体中单性花性状呈现单显性基因控制，按照3：1比例分离，进而证明供试材料雄花两性花同株与雌雄异花同株的基因型分别为aaGG和AAGG，并运用RAPD 技术，在F2群体中采用混合分组分析法对A基因进行了分子标记筛选，找到一个与A基因连锁的大小约为500bp的RAPD标记。

虽然已经在甜瓜上找到了不少和主效基因相连锁的分子标记，这将使通过分子标记辅助技术，选择培育更多的甜瓜新品种成为可能。但实际上绝大多数的研究仍停留在标记鉴定、定位、作图等基础环节上；通过分子标记进行辅助选择、提高育种效率、大规模培育优良品系或品种的期望还远未实现。目前所建立的甜瓜遗传图谱中的部分分子标记在不同的遗传图谱中不能通用，且尚未建立起比较完善的、具有普遍参考意义的甜瓜遗传图谱。

（四）分子标记辅助选择

分子标记辅助选择（marker-assisted selection，MAS）主效基因抗性方法越来越受到重视。MAS指的是通过选择一个和目标基因紧密连锁的标记物（或者是两个两端区域的标记物）对一个或更多个抗性基因进行选择。标记辅助选择（MAS）不受环境条件的限制，能实现早期选择，可省去接种试验和田间大批量试验，缩短育种周期，从而提高选择的有效性。然而分子标记辅助育种在甜瓜上并没有取得大的发展，究其原因，主要是以往的研究，没有把分子标记鉴定与辅助育种这两个重要环节融为一体，绝大多数的研究者只把工作目标定位在鉴定重要的标记上，而未把标记辅助育种纳入自己的工作目标。因而，他们在设计寻找标记的研究方案时，选材上往往只考虑鉴定标记的可行性，而没有从直接培育新的优良品系，或品种的目标去考虑选择起始亲本，因而在获得标记的时候，只能提供育种的中间种质材料。另一方面，分子标记的鉴定技术及辅助选择技术体系也还有待于进一步提高与完善。对于控制质量性状的单个或少数几个基因的标记鉴定，在技术上是可行的，但由于大多数重要的园艺性状如产量、品质等都属于多基因控制的数量性状，对其进行标记鉴定和准确定位不仅耗资巨大，周期长，而且技术难度也很大，因此仍有待于深入研究。

在人类基因组中有哪些遗传标记？用它们能为科研和应用做什么服务？

遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生物化学标记、免疫学标记 和分子标记五种类型。 形态学标记 形态标记是指肉眼可见的或仪器测量动物的外部特征 (如毛色、体型、外形、皮肤结构等)，以这种形态性状、生理性状及生态地理分布等待征为遗传标记，研究物种间的关系、分类和鉴定。形态学标记研究物种是基于个体性状描述，得到的结论往往不够完善，且数量性状很难剔除环境的影响，需生物统计学知识进行严密的分析。但是用直观的标记研究质量性状的遗传显得更简单、更方便。目前此法仍是一种有效手段并发挥着重要作用。 细胞学标记 细胞遗传标记是指对处理过的动物个体染色体数目和形态进行分析，主要包括：染色体核型和带型及缺失、重复、

生物分子标记

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分

分子标记的应用领域

基因组作图和基因定位研究
长期以来，各种生物的遗传图谱几乎都是根据诸如形态、生理和生化等常规标记来构建的，所建成的遗传图谱仅限少数种类的生物，而且图谱分辨率大多很低，图距大，饱和度低，因而应用价值有限。分子标记用于遗传图谱构建是遗传学领域的重大进展之一。随着新的标记技术的发展，生物遗传图谱名单上的新成员将不断增加，图谱上标记的密度也将越来越高。建立起完整的高密度的分子图谱，就可以定位感兴趣的基因。
基于图谱克隆基因
图位克隆(Map—bascd cloning））是近几年随着分子标记遗传图谱的相继建立和基因分子定位而发展起来的一种新的基因克隆技术。利用分子标记辅助的图位克隆无需事先知道基因的序列，也不必了解基因的表达产物，就可以直接克隆基因。图位克隆是最为通用的基因识别途径，至少在理论上适用于一切基因。基因组研究提供的高密度遗传图谱、大尺寸物理图谱、大片段基因组文库和基因组全序列，已为图位克隆的广泛应用铺平了道路。
物种亲缘关系和系统分类中的应用
分子标记广泛存在于基因组的各个区域，通过对随机分布于整个基因组的分子标记的多态性进行比较，就能够全面评估研究对象的多样性，并揭示其遗传本质。利用遗传多样性的结果可以对物种进行聚类分析，进而了解其系统发育与亲缘关系。分子标记的发展为研究物种亲缘关系和系统分类提供了有力的手段。
用于疾病诊断和遗传病连锁分析
1980年，Bostein等成功的将PFLP技术用于镰刀型贫血症的诊断分析，开创了基因诊断的先河。PFLP是以孟德尔方式遗传，因此可以作为染色体上致病基因座位的遗传标志。许多与相连锁的致病基因得以定位。小卫星和微卫星因其高度多态性而被广泛用于疾病诊断和遗传病的连锁分析。随着高通量SNP检测技术方法的出现，作为数量最多且易于批量检测的多态标记，SNP在连锁分析与基因定位，包括复杂疾病的基因定位、关联分析、个体和群体对环境致病因子与药物的易感性研究中将发挥愈来愈重要的作用。

第一代 第二代 第三代分子标记各有什么特点

　　分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。

　　1. 1 第1 代分子标记

　　1.1. 1 RFLP 标记技术。

1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术 。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。

　　优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。

　　缺点：在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。另外,RFLP 对DNA 多态性检出的灵敏度不高,RFLP 连锁图上还有很多大的空间区。

　　1.1. 2 RAPD 标记技术。

为了克服RFLP 技术上的缺点,Williams等于1990年建立了随机扩增多态DNA Randomamplified polymorphic DNA ,RAPD) 技术,由于其独特的检测DNA 多态性的方式使得RAPD 技术很快 渗透于基因研究的各个领域。RAPD 是建立于PCR 基础之上的分子标记技术,基本原理是利用一个随机引物(8～10 个碱基) 通过PCR 反应非定点地扩增DNA 片段,然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA 多态性研究。对任一特定引物而言,它在基因组DNA 序列上有其特定的结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量和大小发生改变,表现出多态性。

　　优点：与RFLP 相比,RAPD 技术简单,检测速度快,DNA 用量少,实验设备简单,不需DNA 探针,设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析,不依赖于种属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,而且不需要同位素,安全性好。

　　缺点：当然,RAPD 技术受许多因素影响,实验的稳定性和重复性差,首先是显性遗传,不能识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复杂 ,在基因定位、作连锁遗传图时,会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,而且不需要同位素,安全性好。当然,RAPD 技术受许多因素影响,实验的稳定性和重复性差,首先是显性遗传,不能识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复杂 ,在基因定位、作连锁遗传图时,会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降;其次,RAPD 对反应条件相当敏感,包括模板浓度、Mg2 +浓度,所以实验的重复性差 。

1. 1. 3 AFLP 标记技术

扩增片段长度多态技术(AFLP) ,又名限制片段选择扩增技术(Selective restriction fragment amplifi2cation ,SRFA) ,于1993 年由荷兰KEYGENE 公司的Zabean 和Vos 等发明,并已申请专利。AFLP 是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术,它将基因组DNA 用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与酶切位点互补) 连接起来,并通过5′端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA 片段,从而形成指纹图谱的分子标记技术。AFLP 指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。

　　优点：它兼具RAPD 与RFLP 的优点,有较高的稳定性,用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量位点,并且每对引物所检测到的多个位点都或多或少地随机分布在多条染色体上,各染色体上AFLP 标记的数目与染色体长度呈正相关( r = 0. 501) ,而一对引物获得的标记涉及的染色体数与标记数呈正相关( r = 0. 826) 。因此,通过少量效率高的引物组合,可获得覆盖整个基因组的AFLP 标记 。目前,AFLP 作为一种高效的指纹技术,已在遗传育种研究中发挥它的优势。

　　缺点：不过也有研究认为,AFLP 对基因组纯度和反应条件要求较高,另外用于遗传作图时,少数的标记与图谱紧密度有出入。此外, 在RAPD 和RFLP 技术基础上建立了SCAR(Sequence characterize damplified regions ,序列特异性扩增区域) 、CAPS(Cleaved ampli2fied polymorphic sequence ,酶切扩增多态序列) 和DAF(DNA am2plified fingerprints ,DNA 扩增指纹) 等标记技术 。这些技术的出现,进一步丰富、完善了第1 代分子标记技术,增加了人们对DNA 多态性的研究手段。

　　1. 2 第2 代分子标记

1. 2. 1 SSR 标记技术。

在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列,如重复单位长度在15～65 个核苷酸的小卫星DNA(Minisatellite DNA) ,重复单位长度在2～6 个核苷酸的微卫星DNA (Microsatellite DNA) 。小卫星和微卫星DNA 分布于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以拷贝数不同,从而构成丰富的长度多态性。Moore 等于1991 年结合PCR 技术创立了SSR (Simple sequence repeat ,简单重复序列) 标记技术。SSR 也称微卫星DNA ,是一类由几个(多为1～5 个) 碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列,其中最常见的是双核苷酸重复,即(CA) n和(TG) n ,每个微卫星DNA 的核心序列结构相同,重复单位数目10～60 个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。不同遗传材料重复次数不同,导致了SSR 长度的高度变异性,这一变异性正是SSR 标记产生的基础。SSR 标记的基本原理:根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物,通过PCR 反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复数目不同,因而扩增出不同长度的PCR 产物,这是检测DNA 多态性的一种有效方法。微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性,而且一般为共显性,因此是一类很好的分子标记。目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠、水稻、小麦、玉米等物种的染色体遗传图谱。

　　优点：这些微卫星标记已被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、农作物育种、进化研究等领域。此外,SSR 标记不仅能够鉴定纯合体和杂合体,而且结果更加可靠,方法简单,省时省力。

1. 2. 2 ISSR 标记技术。

ISSR 即内部简单重复序列,是一种新兴的分子标记技术。1994 年Zietkiewicz 等对SSR 技术进行了发展,建立了加锚微卫星寡核苷酸(Anchored microsatellite oligo nucleotides) 技术 。他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物,即在SSR 的5′端或3′端加上2～ 4 个随机选择的核苷酸,这可引起特定位点退火,从而导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR 扩增。这类标记又被称为ISSR ( Inter2simple

　　sequence repeat ) 、ASSR(Anchored simple sequence repeats) 或AMP2PCR 。在所用的两翼引物中,可以一个是ASSR 引物,另一个是随机引物。如果一个是5′端加锚的ASSR 引物,另一个是随机引物,则被称为RAMP 技术[19] 。用于ISSR2PCR 扩增的引物通常为16～18 个碱基序列,由1～4 个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA 中SSR 的5′或3′末端结合,通过PCR 反应扩增SSR 之间的DNA 片段。

　　优点：SSR 在真核生物中的分布是非常普遍的,并且进化变异速度非常快,因而锚定引物的ISSR2PCR 可以检测基因组许多位点的差异。与SSR2PCR 相比,用于ISSR2PCR 的引物不需要预先的DNA 测序,也正因如此,有些ISSR 引物可能在特定基因组DNA 中没有配对区域而无扩增产物,通常为显性标记,呈孟德尔式遗传,且具有很好的稳定性和多态性。

　　1. 3 第3 代分子标记

1. 3. 1 SNP 标记技术。

单核苷酸多态性(Single nucleotidepolymorphism ,SNP) 被称为第3 代DNA 分子标记,是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异,这种差异包括单个碱基的缺失或插入,更常见的是单个核苷酸的替换,且常发生在嘌呤碱基(A 与G) 和嘧啶碱基(C 与T) 之间。SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异,被认为是应用前景最好的遗传标记。目前,已有2 000 多个标记定位于人类染色体上,在拟南芥上也已发展出236 个SNP 标记。在这些SNP 标记中大约有30 %包含限制性位点的多态性。

　　优点：检测SNP 的最佳方法是DNA 芯片技术,最新报道的微芯片电泳(Microchip electrophoresis) ,可以高速度地检测临床样品的SNP ,它比毛细管电泳和板电泳的速度可分别提高10 和50倍 。SNP 与第1 代的RFLP 及第2 代的SSR 标记的不同有2 个方面:其一,SNP 不再以DNA 片段的长度变化作为检测手段,而直接以序列变异作为标记;其二,SNP 标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳,代之以最新的DNA 芯片技术。

1. 3. 2 EST 标记技术。

表达序列标签( Expressed sequence Tag , EST)是美国国立卫生研究院(National Institutes of Health ,NIH) 的生物学家Venter 于1991 年提出的。随着人类基因组计划的开展,EST 技术首先被广泛应用于寻找人类新基因,绘制人类基因组图谱,识别基因组序列编码区等研究领域,之后又被广泛应用于植物基因组研究。EST 是指在来源于不同组织的cDNA 文库中随机挑选克隆、测序,得到部分cDNA 序列,一个EST对应于某一种mRNA 的cDNA 克隆的一段序列,长度一般为150～500 bp ,只含有基因编码区域。

　　优点：EST可代表生物体某种组织某一时间的一个表达基因,所以被称之为“表达序列标鉴”;而EST的数目则显示出其代表的基因表达的拷贝数,一个基因的表达次数越多,其相应的cDNA 克隆越多,所以通过对cDNA 克隆的测序分析可以了解基因的表达丰度。目前构建cDNA 文库一般都使用试剂盒,方法成熟,而且飞速发展的DNA 测序技术,也使得进一步降低大规模DNA 序列测定成本成为可能 。