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哪位可以提供成功转染raw264.7小鼠巨噬单核细胞步骤及注意事项？

教育综合
2024-07-03 07:57:11

哪位可以分享转染raw 264.7细胞经验？

为了转染raw 264.7小鼠巨噬单核细胞我们实验室尝试了lipo3000、,FuGENE 6、FuGENE HD、Effectene等其它转染试剂，对于我们8000bp的质粒DNA基本转染后都没有荧光信号；师兄在中山大学的同学给我们推荐了他们实验室用Zeta Life Advanced DNA RNA货号AD600050转染raw 264.7细胞经验分享。

按照中山大学师兄给出的方法并结合我实验室情况我把自己在6孔板转染raw 264.7细胞的相关经验整理如下，希望对你转染raw 264.7细胞有一定的帮助，下面是我首次用转染raw 264.7细胞的荧光和细胞明场图片，后期进一步优化后的新图片我也会随后呈上：

一、质粒DNA准备

1、质粒DNA浓度700ng/ul（注意：①溶解于无菌双蒸水或超纯水；②无内毒素），我用QIAGEN试剂盒除去的内毒素

二、操作流程

1、先将细胞接种到细胞培养板，细胞汇合度在70%左右，再进行转染。

2、复合物制备：将质粒DNA与Zeta Life Advanced Transfection Reagent AD600050转染试剂按照1:1（12ug:12ul）关系直接混合，用移液器吹吸10-15次混匀，室温静止10-15分钟。

3、将复合物加入完全培养基的细胞培养板，并轻轻混匀，放入培养箱中继续培养（不建议把复合物加入到无血清的培养基里面，我后期会进一步摸索此条件）。

4、转染24小时后对细胞进行正常换液。

5、质粒DNA转染48小时后荧光检测转染效率

三、注意事项：

1本转染方法不适用在下面转染试剂的转染如：lipo3000、,FuGENE 6、FuGENE HD、Effectene等转染试剂；

2细胞培养基：Zeta Life公司 z7181-500胎牛血清，Gibco公司DMEM;

RAW264.7细胞转染详细点的注意事项及操作步骤

1.细胞接种：一般做转染前一天接种/铺板（细胞计数大约5*10^4cell/ml），使做转染前细胞密度在30-50%。 2.为了能在使用时有较好的转染效果，第一次使用建议您用24孔板做，每孔2ul转染试剂即可。将最佳转染条件（siRNA与转染试剂的用量、比例）放大到对应的孔板即可。 3.设置siRNA终浓度10nM,30nM,50nM,100nM四个梯度，每个梯度最好做2-3个复孔（至少2个复孔，避免实验误差）。 4.用来稀释siRNA和Rfect的培养基必须是无血清培养基，因为血清的存在会干扰siRNA与转染试剂的混合，并且影响转染效率。 5.检测方法：转染后48h收细胞做qPCR基因水平检

有哪位做过RAW264.7巨噬细胞的转染吗

请先把细胞养好，我实验室用Advanced Transfection Reagent转染试剂AD60015做了24孔板转染RAW264.7小鼠单核巨噬白血病细胞的转染，转染体系大概总结如下转染质粒DNA：pcDNA3.1-GFP 质粒DNA大小：8000bp 转染完全培养基用量：500ul 转染试剂用量：2.5ul 转染细胞密度：80%