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将A和B两个菌株分别接种于戴维斯U型管的两侧,经过反复抽气与充气后,若检测到两个菌株间

教育综合
2024-06-30 17:44:25

以二倍体糖化酵母A和B为出发菌株，欲通过有性杂交技术选育糖化酵高产菌株，设计一个育种的实验方案

与题目不符，但希望能作为参考一、实验原理酵母菌的生活史属于双单性类型，它们的单倍体细胞和二倍体细胞一般都能进行无限制的分裂。以单倍体细胞为主的酵母菌称为单倍体酵母，例如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharamycespombe）。以二倍体细胞为主的酵母菌称为二倍体酵母，如啤酒酵母（又称面包酵母，Saccharomycescerevisiae）。这两种酵母常用作遗传学研究的材料，而啤酒酵母在酿酒工业和食品工业中又有很大的应用价值。本实验用异宗配合型的啤酒酵母的单倍体菌株进行杂交实验。任何一株酵母菌，如果使二倍体的营养细胞处于形成孢子的条件下，都会发生减数分裂，生成四分体和子囊。每个子囊孢子具有四分子核，正常情况下子囊中有4个子囊孢子，其中有2个a和2个α，a和α表示两种相对的接合型。具有这两种接合型的子囊孢子萌发生长成单倍体的菌株，不同接合型的单倍体菌株细胞接合生成二倍体菌株。具有这样生活史的酵母菌称为异宗配合型酵母。异宗配合型啤酒醇母的生活史见图11－1。单倍体菌株分属a和α两种接合型，是受一对等位基因a和α控制的，这对等位基因的座位在第三连锁群靠近着丝粒的地方。在光学显微镜下观察酵母的染色体是十分困难的，但借助于电子显微镜，对酵母菌的细胞学已了解得较多了。现已知啤酒酵母具有17个连锁群（n=17）。两个属于不同接合型的营养缺陷型的酵母单倍体菌株，在基本培养基上都不能形成菌落。当它们杂交形成二倍体杂种细胞，就能在基本培养基上生长。二倍体杂种细胞在形成子囊孢子过程中，发生染色体重组，而使产生的子囊孢子出现重组性状。二、实验目的通过酵母菌杂交实验了解异宗配合型啤酒酵母的生活史和基因自由组合定律，掌握酵母菌杂交的基本方法。三、实验材料1.啤酒酵母单倍体腺嘌呤缺陷型（ade-），接合型为a；2.啤酒酵母单倍体组氨酸缺陷型（Hisl-），接合型为α。四、实验器具和药品1.用具：试管，离心管，离心机，吸管，培养皿，三角烧瓶，涂布棒，石英砂。2.药品：生理盐水（0.85克NaCl溶于100毫升蒸馏水中，15磅压力下消毒15分钟），纤维素酶或蜗牛酶。3.培养基：（1）完全液体培养基：蛋白胨2克，酵母浸母汁1克，葡萄糖2克，水100毫升，pH6.0，8磅压力下灭菌30分钟。（2）完全固体培养基：在完全液体培养基中加2％琼脂。（3）基本液体培养基：葡萄糖10克，（NH4）2SO41克，K2HPO40.125克，KH2PO40.875克，KI*母液1毫升，MgSO4·7H2O0.5克，CaCl2·2H2O0.1克，NaCl0.1克，微量元素母液**1毫升，维生素母液***1毫升，水1000毫升，pH5.3，8磅压力下灭菌30分钟。*KI母液：10毫克KI于100毫升水中。**微量元素母液：H3PO41毫克，ZnSO4·7H2O7毫克，CuSO4·5H2O1毫克，CoCl2·6H2O5毫克，水100毫升。***维生素母液：烟碱酸40毫克，维生素B140毫克，肌醇200毫克，核黄素20毫克，对-氨基苯甲酸20毫克，吡哆醇40毫克，泛酸40毫克，生物素0.2毫克，水100毫升。（4）基本固体培养基：在基本液体培养基中加2％琼脂。（5）产孢子培养基：CH3COONa8.2克，KCl1.86克，吡哆酵母液*1毫升，泛酸母液**1毫升，生物素母液***1毫升，琼脂20克，蒸馏水1000毫升。*吡哆醇母液：20毫克吡哆醇/100毫升水。**泛酸母液：20毫克泛酸/100毫升。***生物素母液：2毫克生物素/100毫升。（6）补充培养基：a.基本固体培养基100毫升加组氨酸3.5毫克。b.基本固体培养基100毫升加腺嘌呤3毫克。五、实验步骤1.取盛有完全固体培养基斜面的试管4支。把ade-和Hisl-两菌种各接种在二支斜面上。30℃温箱中培养24小时。2.用5毫升生理盐水洗下一支ade-斜面上的菌，再倒入另一支ade-试管中，洗下的菌最后倒入无菌离心管中。另取5毫升生理盐水洗下Hisl-二支试管斜面的菌，倒入无菌离心管中。这样制成的菌液，浓度约108/毫升。3.两亲本菌液各吸0.5毫升，放入5毫升完全液体培养基中，30℃静止培养2小时。4.离心（3000转/分，3分钟），30℃静止培养半小时。5.倒去上清液，打匀管底菌块，再加入6毫升新鲜完全液体培养基，30℃培养过夜。6.离心，倒去上清液。再加6毫升新鲜完全液体培养基，洗一次，离心，倒去上清液。7.将离心管中的沉淀菌接种在产孢子培养基斜面上，30℃培养2—3天。在显微镜下观察杂交后形成的子囊，可见其中有4个子囊孢子。8.测定子囊孢子的表型推断其基因型：（l）在长有子囊的斜面上加基本培养液2毫升，用接种环将子囊刮下，倒入无菌离心管中。（2）在55°—60℃的恒温水浴中加热15分钟，杀死酵母菌的营养体，即单倍体细胞。离心，倒去上清液，加生理盐水到原体积，形成子囊悬液。（3）把孢子悬液倒入消毒过的盛有石英砂的三角烧瓶中，振荡5分钟，使子囊孢子散出，成为子囊孢子悬液。（4）取打散的子囊孢子悬液0.1毫升涂布在完全培养基培养皿上，30℃培养48小时。（5）影印培养：以上面的培养皿为原始培养皿，依次影印：a.基本培养基；b.腺嘌呤补充培养基；c.组氨酸补充培养基；d.完全培养基。30℃培养48小时。（6）生长谱鉴定：a.从原始培养皿上挑取各个已经初步鉴定的菌落，接种在完全培养基斜面上。同时接种在有5ml液体完全培养基的离心管中，30℃培养48小时。b.离心（3000转/分，3分钟。），倒去上清液，打匀沉淀，然后离心洗涤三次，最后加生理盐水至原体积。C.吸取菌液0.1毫升，移至灭过菌的空培养皿中。然后倒入融化后冷至40°—50℃的固体基本培养基，摇匀，待凝。各做1皿。d.在每一培养皿的皿底划分四格，两格放少量组氨酸结晶粉末，另两格放少量腺嘌呤的结晶粉末。然后放到30℃温箱培养48小时。e.观察生长情况，营养缺陷型菌株会在所需物质的周围长出来。如需要两种物质，就只能在两种物质都扩散到的地方生长。操作步骤见图11-2。9.实验步骤说明：（1）步骤3—6，是为了用营养丰富的培养基培养好的新鲜细胞，并使不同接合型的细胞充分接触，形成合子，为产生孢子创造条件。（2）步骤7中，由于酵母在产孢子培养基上不会增殖，所以要求接种足够多的细胞，使杂交形成的子囊不至于过少。（3）步骤8（3），要从子囊中取得子囊孢子，也可用蜗牛酶充分处理子囊后，用超声波处理使子囊孢子充分分散。蜗牛酶处理温度为30°—37℃，15—30分钟。没有蜗牛酶，用石英砂振荡，也能使子囊壳破碎，散出子囊孢子。（4）酵母菌是单细胞真菌，不形成菌丝，所以在步骤8（5）中可采用影印方法。六、实验结果1.影印结果：能生长用“＋”表示，不能生长用“—”表示，并计算菌落数。2.生长谱鉴定：3.影印与生长谱鉴定结果相比较，看结论是否一致。4.实验结果说明：本实验用的啤酒酵母营养缺陷型单倍体菌株，有关的ade和Hisl基因属于不同的连锁群，是两对基因的自由组合。因此在实验结果中，单倍体基因型的比例应为＋＋∶ade-∶Hisl-∶ade-Hisl-＝1∶1∶1∶1。单倍体菌株的表型比也应为1∶1∶1∶1。表型分离比直接反映了基因型的分离比。

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防治作物害虫的微生物
苏云金杆菌杀虫晶体蛋白是现今最为成功的生物防治昆虫的方法，科学家开发其它种类的生物性杀虫剂，可填补杀虫晶体蛋白的不足，做为作物害虫防治时，轮替使用的管理策略。目前其它可用的生物性防治昆虫的工具有：杆状病毒、虫生真菌及虫生线虫等。苏力菌杀虫晶体蛋白的主要标的是昆虫的幼虫，对成虫是没有作用的。杆状病毒、虫生真菌以及虫生线虫都能感染昆虫成虫，这些生物防治制剂与杀虫晶体蛋白具有相辅相成的作用。
杆状病毒：杆状病毒对昆虫的感染有极高的专一性，其它动物不会成为杆状病毒的标的。虽然如此，病毒对标的昆虫的致死力却十分缓慢，故杀虫效果不佳。为了弥补这个缺点，科学家已利用遗传工程技术，将其它毒素基因或激素基因选殖进入杆状病毒内。在病毒感染标的昆虫的同时，选殖在病毒内的毒素或激素便可在标的昆虫体内大量合成，因而可加速昆虫的致死时间。北非毒蝎的神经毒素基因转殖入杆状病毒就是一个颇为成功的例子。此外科学家又把昆虫的变态青春激素基因选殖入杆状病毒，经感染后，标的昆虫因受到激素的刺激而开始进行变态作用，导致昆虫停止进食，因而达到生物防治的目的。
虫生真菌：由于虫生真菌对昆虫有极高的感染专一性，很多对杀虫晶体蛋白没有作用的昆虫，虫生真菌可对其产生毒害作用，因此是杀虫晶体蛋白的一种互补性代用品。常用的虫生真菌及其作用有：黑僵菌——作用于叶蝉；绿僵菌——作用于大尾熊蝉；紫僵菌——作用于蜘蛛；青霉菌——作用于金花虫；虫霉菌——作用于蚊虫；以及冬虫夏草菌—— 作用于蝇类昆虫等。
虫生线虫：每一种虫生线虫都会与一种属肠细菌科的细菌共生，利用虫生线虫的保护，肠内共生菌可顺利进入昆虫体内，而避免了昆虫对细菌的抗性作用。进入昆虫后，肠内共生菌会在昆虫的血体腔中大量繁殖，致使昆虫死亡，并分解昆虫组织，以做为线虫的食物来源。这样的共生系统也是一种生物防治昆虫的好方法。
微生物农药
今后的蔬菜生产在农药使用方面要求将更加严格，现阶段各级政府积极倡导微生物农药的使用。
微生物农药是一类发展较快的生物农药。微生物农药包括农用抗生素和活体微生物。农用抗生素是由抗生菌发酵产生的、具有农药功能的代谢产物，例如：井冈霉素、春雷霉素等，可以用来防治真菌病害；农用链霉素、土霉素可以用来防治细菌病害；浏阳霉素可以用来治蛾类；最新开发的阿维菌素可以用来杀灭害虫、畜体内外寄生虫，用量低、效果好。活体微生物农药是有害生物的病原微生物活体，即用了这些活的微生物可以使有害生物本身得病而丧失为害能力。例如，白僵菌、绿僵菌是一类真菌杀虫剂(即本身是真菌，具有杀虫活性)；苏云金杆菌(即Bt)是一类细菌杀虫剂；核多角体病毒是一类杀虫剂；鲁保一号是一类真菌除草剂。
微生物农药是以生物体如细菌、真菌、病毒等微生物为原料而制成的一类农药。它的特点是安全可靠，不污染环境，对人畜不产生公害，而且原料易获得，生产成本低，是当前农作物病虫害防治中具有广阔发展前景的一种农药。生产中常见的生物农药有以下几种：
Bt乳剂：是常用的细菌生物农药，它的制成品为米黄色乳剂，乳化性能好，杀虫谱广，对20多种蔬菜、茶、果、烟等植物的鳞翅目害虫防治效果为80- 90%，主要防治对象有松毛虫、玉米螟、棉铃虫、粘虫、稻纵卷叶螟、茶毛虫等。Bt乳剂是一种胃毒剂，害虫食后能产生一种特殊的酶。这种酶可以分解昆虫肠道当中的一种蛋白质，从而使害虫肠道穿孔，肠道里的东西流入体腔，最后死亡。使用时应掌握气温在15℃以上，一般以20℃为适宜，施用时间应比施用化学农药提前2-3天为宜。
青虫菌和杀螟杆菌：菜青虫吃了粘有青虫茵的菜叶，肠壁会很快穿孔，变成团团泥浆死去。杀螟杆菌用于防治稻纵卷叶螟、三化螟，还能防治苍蝇、蚊子、松毛虫、白蚂蚁、稻苞虫等害虫。
白僵菌：是真菌生物农药，对防治松毛虫和水稻害虫黑尾叶蝉有特效。白僵茵液接触害虫后，通过体壁进入害虫体内，很快会萌发菌丝，吸收害虫的体液，使害虫变僵发硬而死。
井冈霉素：防治水稻纹枯病有特效。抑制水稻纹枯病病菌菌丝，有效期长达20天，耐雨水冲刷，对人畜安全无毒。
农用抗菌素和植物抗菌素：这两类农药是真菌生物农药。在生产上应用的抗菌素有春雷霉素、庆丰霉素、多抗霉素、土霉素、灰黄霉素、放线菌酮链霉素等。如农抗120是一种新型的农用抗生素，对瓜、果、蔬菜、花卉、麦类、烟草的白粉病及水稻、麦类的纹枯病，具有很好的防治效果。（王铜）
林业害虫微生物防治进展
□吴钜文（北京市农林科学院植保环保所北京 10089）
摘要：文章叙述了昆虫病原真菌、昆虫病原细菌、昆虫病毒等昆虫病原微生物及复合型微生物杀虫剂。并对使用面积最大的球胞白僵菌杀虫剂的生产，产品质量标准检验、产品包装及防治对象和应用效果作了较详细的阐述。此外，还介绍了防治林业主要害虫具很大活力的昆虫病原线虫的应用。
关键词：病原微生物白僵菌复合微生物杀虫剂线虫
我国森林害虫有4000～5000种，易于暴发成灾的重要害虫达几十种，每年发生面积近600万公顷，如松毛虫年发生达150万公顷，杨树蛀干害虫发生近50万公顷，杨树食叶害虫达70万公顷，大小蠹虫近30万公顷等等,每年国家需要投入巨额经费开展防治，以保护绿化的成果和挽回经济损失。
结构合理、健康的森林（如原始林和次生原始林）属于K类较稳定的生态，害虫与天敌处于相互制约的动态平衡，除非有极大的干扰因素（如气候、人为因子）一般不会破坏这种平衡，不会形成虫灾。仅以松毛虫为例，我国已知天敌达530种，包括天敌昆虫314种（寄生蜂类168种，寄生蝇类48种，捕食性昆虫146种）捕食性动物198种（鸟类117种，蜘蛛69种，其它13种），病原微生物17种（真菌9种，细菌5种，病毒4种）（吴钜文，1979，1990a）。在东北区截止1984年统计亦知松毛虫天敌达527种（吴钜文，1990b）。但现在森林害虫成灾的多为人工林或遭破坏后的次生林，树种单纯，间伐修枝过度，甚至乱砍滥伐，郁闭度低，植被稀少，加之使用广谱性化学农药等等，形不成稳定的森林生态系统，不具有生物多样性能发挥的生态平衡效应，即没有自控能力的森林，虫灾的发生不可避免。随着人们认识的深入和我国经济的发展，对上述林地改造及新造林要考虑因地制宜，适地适树，多树种合理配置，加强保护和管理，贯彻生物防治，促进形成稳定的森林生态系统，提高自控作用，实现可持续林业的总目标已是势在必行。
本文仅就近十年来我国一些实用的微生物防治技术在林业害虫防治中取得的进展做简要综述。
1 昆虫病原真菌
1.1 白僵菌
1.1.1菌种株系筛选鉴定：现已能利用RAPD-PCR检测3种白僵菌及地孢白僵菌种内变异（李增智等，1998），菌株间的DNA图谱表现了明显的多态性，但与寄主和采集地未表现相关性（林华峰等，1998）。室内测定表明，白僵菌胞外蛋白酶产量大的菌株，松毛虫死亡率高，而产孢量大小与菌株毒力之间没有明显相关性（樊美珍，1994）。通过紫外诱变获得了CHI1316菌株，几丁酶活力提高3倍，遗传稳定（彭仁旺等，1995）。紫外线对白僵菌的影响表现在孢子活率降低和孢子萌发延迟，使毒力下降两方面，两者和毒力的相关性为0.8293和0.8448，均达极显著水平，因此白僵菌在使用过程中，孢子在环境中的稳定性受紫外光影响较大，菌株的杀虫效果很大程度上取决于孢子的抗紫外线能力（黄和春等，1998），此外，白僵菌对马尾松毛虫幼虫毒力高低，也与孢子萌发中的（GT50）相关极显著（林华峰等，1998C）。
1.1.2白僵菌的生产：我国过去一直沿用固体培养方法，菌剂质量差，成本高，生产周期长（约15天），产品不能定型，影响防治效果和面积。湖南微生物所1993年采用液固两相一体化生产新工艺，可以优质、快速、大量生产球孢白僵菌，菌粉孢量达150～200亿/克。采用全密闭式抽风负压分离技术的高孢子粉含量达1000亿/克，2个1500升发酵缸每月可产2600kg高孢粉。高孢粉便于贮存和运输，能用于多种剂型配制（缪文超，1993）。中国农科院生防所研制的白僵菌可湿性粉剂，含孢量500亿/克，悬浮率＞90%，田间使用可避免粉尘飞扬（张爱文等，1992）。安微农大生产的“951白僵菌油剂”含白僵菌高孢粉50%，抗氧剂5%，增活剂CII0.025%，增效剂M0.01%、紫外吸收剂A0.01%和溶剂油S，常温下贮存8个月，孢子萌发率40%，对马尾松毛虫测定白僵率达56%，该剂型已建立企业标准（李农昌等，1996），广东省林科院已使白僵菌生产工艺规范化，生产周期缩短51.1%，成本降低21.35%，建立了企业标准（殷风鸣、潘务耀、李增智，1996）。这些重大的改进，已使我国成为世界上唯一能生产高孢粉的国家，白僵菌的产量居世界第一。
1.1.3产品质量标准与质检技术：对于3种白僵菌及球孢白僵菌菌株可用RAPD-PCR鉴定（李增智，1998），对于产品的含孢量可用分光光度法测定（王成树，1998），对于标准菌株，安徽农大提出用数值分类法筛选球孢白僵菌中心菌株作为标准株，即:对测试菌培养性状编码，由所得8个指标对供试菌株求相关系数矩阵，根据不同菌株所在行、列的相关系数求得平均相似值S，S＞755的菌株具备中心菌株条件，将标准菌株毒力与其它菌株相比较，得到不同菌株的毒力效价单位(王成树，1999)。对于生测指示昆虫，全国森防总站经过筛选，认为白纹伊蚊幼虫较适宜，对白僵菌较敏感，LC50=7.06-8.83mg/ml，并建议用球形芽孢杆菌SP1188作标准品（周新胜，1996，1997）。为使我国白僵菌产品实现政府登记，步入商品化生产，迫切需要建立产品质量标准及质检技术方法。
1.1.4产品贮存、包装：作为商品生物制剂存贮期应达2年才具市场价值。在我国北方10～20℃，RH33～50%的条件下，白僵菌孢子粉的贮存期可达2年以上（杨敏芝等，1994）。在浙江将孢子粉置入石灰缸内可贮6个月（10月至4月），孢子发芽率由87.2%降至81.5%基本保持质量。安徽对白僵菌混合粉剂采用充氮包装，在室温（经过夏天）贮藏半年，孢子萌发率仍达70.56%，而对照仅为30.96%（王成树等，1997）。
1.1.5生物学特性与使用技术：研究表明，0～10℃自然变温下，白僵菌孢子不萌发侵染（林华峰等，1999）并且寄主有一定免疫防御能力，尤其在低温环境中更易显现（林华峰，1998a）。我国马尾松毛虫2～3代区，冬春RH＜85%，过去提倡的冬前或冬季施用白僵菌是不适宜的，主张一般年份在6月份放菌防治第一代幼虫（林华峰等，1998b）。实践表明只有在18～24℃、RH＞90%温湿双因子共存时才有白僵病的流行（梁修山等，1999）。
1.1.6防治对象与应用效果：我国应用白僵菌防治马尾松毛虫已有30年的历史，浙江用高孢粉（1600～2100亿/g）1kg/公顷使松毛虫死亡率达80～92%（吴正东等，1994）；湖南从1985年起连续8年施用白僵菌79吨，防治松毛虫4.3公顷，致死率＞85%（黄向东等，2000）。近年来扩大应用范围，防治多种林业害虫都已取得较好防效，如在广东用白僵菌（星天牛菌株）粘、膏、涂孔法防治木麻黄的星天牛，20天后死亡率达70%，30天后达100%，（五素草等，2000）但安徽由蛀孔注射菌防治松祸天牛的僵虫，死亡率达10.5-18.3%（孙继美等，1997）。在云南防治松针斑蛾（Elerusia lcptalina)，幼虫、蛹总僵死率78.6—88.1%（李学萍，1998），东北在土壤施用白僵菌（菌株采自上中）防治落叶松球果花蝇（Strobilimyica spp），死亡率64.7～81.1%（阎峻等，1995）。但防治落叶松叶蜂效果仅28～52%（周淑芷等，1994）。安徽用白僵菌喷雾防治一字竹象Otidognathrs davidis效果达72.2%（将德冀等，1994）。江西在5月20℃、RH＞90%竹蝗1龄盛期施放白僵菌，跳蝻死亡率达80%以上（黄烈燕，1994）。随着我国白僵菌系列产品的发展，将会在林虫防治上发挥更大的作用。
1.2 布氏白僵菌
布氏白僵菌对地下害虫有较强的寄生能力，在东北用112.5～150kg/公顷施用对苗圃大黑鳃金龟防效66.9%～85.0%，僵虫率55.6%～68.4%（李兰珍等，1998）。
此外，广东应用蜡蚧轮枝菌防治大发生的湿地松粉蚧Oracclla acula取得显著防效，林地用16.5×1012及33×1012孢子/公顷，死亡率达92.7%及99.5%(潘务耀等，1994；殷风鸣等，1994），是昆虫病原真菌在林虫防治上的又一资源。
2 昆虫病原细菌
苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis)制剂占国际生物农药市场销售额的80%，广泛应用于各国农林害虫的防治，在我国已应用于50多种森林害虫的防治。除已生产的菌种之外，我国进行了苏云金杆菌的资源调查，Bt在我国森林土壤中的分离率平均为4.21%。出土率为14.32%，分离的Bt60%对森林主要害虫（杨扇舟蛾、舞毒蛾、马尾松毛虫）高效，分布调查的优势亚种为库尔斯塔克亚种(B.t.subsp,kurstaki)和松虫蜀亚种(B.t.subsp.dendrolimus)（戴莲韵等，1994）。近年，中南林学院从马尾松毛虫虫粪分离出Bt“62菌株”（H4血清型为一新的酯酶型）对15种鳞翅昆虫效果好，气温越高死亡越快，最短只4～6小时，与湿度关系不大。对马尾松毛虫5龄虫2架次飞防，累积死亡率在90%上，并有明显的后效作用（黄健屏，1998）。江苏用Bt781（含活芽孢120亿/ml）25倍液对侧柏毒蛾的防效达90%以上（冯柱永等，1994）；重庆用Bt苏力保（1）水剂（8000IU/μl）300倍液防治柏木、柳杉林的大害虫鞭角化扁叶峰Chinolyda flagellicorinis，效果达86.7%（王满园等，2000）。在北方应用Bt防治美国白蛾各龄幼虫效果都好（阎志利等，1999）。广东用当地采到的蜡状芽孢杆菌Bacillus cerus5×107孢子/ml悬浮液防治木麻黄林间的棉蝗，6天后防效达77.9%（刘清浪等，1999）。目前国内急需高质量的Bt商品制剂，特别用于防治鞘翅目害虫的Bt制剂（B.t.subsp.tenebrjonis)对于防治林业上当前的一些严重害虫如天牛、小蠢、叶甲、象甲等，更是迫切。
3 昆虫病毒
3.1 质型多角体病毒CPV
我国已发现松毛虫病毒12种以上，以质型多角体病毒应用最广，效果最好（陈吕洁，1990）。云南省从1984～1994年推广应用文山松毛虫质型多角体病毒（DpwCPV）防治文山松毛虫、云南松毛虫及思茅松毛虫4282.3公顷，当年防效70.0～92.8%，持续感染明显。DpwCPV致病力强，毒力稳定，并有继代感染作用，防治一次能持续感染，扩散流行，可控制松毛虫3～5年不成灾，成本低于烟雾剂，而且对人畜安全无污染（陈民雄等，1997）。四川应用德昌松毛虫质型多角体病毒（DpwCPV）防治松毛虫，持续效果明显，病毒能通过带毒成虫经卵传给子代，造成子代幼虫大量感病死亡，能控制处理区5年有虫不成灾，郁闭度大的林分，持续效果已达12年（苏志远等，1999）。湖南以GPS导航飞机喷洒马尾松毛虫质型多角体病毒（DpwCPV）14×108～18×108PTB/g，45g/hm2，每架次处理100～133.3hm2，对松毛虫防治效果达85%，成本仅16.5元/hm2（黄向东，1999）。中科院武汉病毒所等在湖南用携带DpwCPV赤眼蜂防治松毛虫效果达94～97.3%，比单用赤眼蜂（74.6～81.2%）效果高，用赤眼蜂传播病毒比在林间直接喷洒病毒可节省大量病毒制剂（彭辉银等，1998），是生物防治的一种途径。
对于松毛虫病毒的增殖，在云南是采用人工集虫饲养松毛虫增殖CPV、在林间选择虫口、环境适宜的林分增殖CPV或结合大面积防治回收感病虫等三种经济实用方法（胡光辉，1996，1998）。而广东林科院发现可用棉铃虫增殖，用DpCPV对8种鳞翅目昆虫进行感染，以棉铃虫最敏感，染病率为97.0%，LC50为7.65×104PTB/ml，获得的Ha-DpCPV与原毒种DpwCPV形态特征相同，用于4～5龄松毛虫毒力较强，LC50=1.14×104PTB/ml。因此以人工饲养棉铃虫作为替代寄主较理想，将病毒喷在人工饲料表面饲喂棉铃虫，平均每虫可获8.13亿PTB，与原宿主的病毒产量接近，用Ha-DpCPV在林间防治一、二代马尾松毛虫效果达60.2～54.0%（曾陈湘等，1997）。
对于林间效果的监测，复旦大学与中国林科院合作，以纯化的粒子为抗原制备了4种甲克隆抗体，并进行了病毒抗原合成和病毒增殖动态检测，用所建立的免疫检测方法，对几批采用DpCPV防治林区的幼虫样品分析结果表明，方法适用于对DpCPV的防治效果及其自然流行进行长期、大规模的监测（朱光旦、林军、陈昌洁，1999）。
3.2 核型多角体病毒NPV
在我国多种森林害虫发现NPV，并且应用的效果较好。落叶松尺蠖核型多角体病毒（ZrNPV）在自然界发病率＞75%,用1.216×108PIB/ml对1-4龄幼虫致死率分别为96.23%、96.81%、91.55%和93.56%（王志英等，1994）。山东柏毛虫核型多角体病毒（DpCPV）对3龄幼虫LC50=5188PIB/ml，病毒粉剂在野外防效为80%（陈发仁等，1994）。在四川三陕库区用蜀柏毒蛾核型多角体病毒（PoCPV）4.5×109PIB/hm2喷粉防治蜀柏毒蛾Parocncria orienta，虫口减退率达76.37%，有较强的致病力，并且存活虫仍有80%带毒率（罗正均等，1998），而在福建5月上旬用PoNPV悬液75×1012PIB/hm2对蜀柏毒蛾的防效＞86%（陈顺立等，1995）。1993年在公主岭23个乡镇大面积应用舞毒蛾NPV防治舞毒蛾幼虫效果达80.32%（赵连吉，1996），在内蒙古应用柳毒蛾NPV能防治柳毒蛾及杨毒蛾，当年产的NPV制剂感染幼虫死亡率94%（LC50=31.5×108PIB/ml）制剂在4℃下贮藏1～3年其活性分别丧失1.9%、3.3%和7.9%（刘振清等，1997），福建用木毒蛾核型多角体病毒（LxNPV-11型）添加粘着剂和紫外防护剂制成的901-1可湿性粉剂和901-2乳剂大面积应用，10天后的防效达80%以上（林继强等，1994，1995）。我国森林害虫NPV资源丰富，具有实用价值，但在其基础理论、大量增殖技术、产品质量标准及质检技术、产品贮存及应用方法以及效果评价等方面尚需深入研究，以期实现商品化生产与管理。
4 复合型微生物杀虫剂
由于各类生物制剂各自都有自己要求或特点，如对高温高湿的要求、对害虫虫龄、虫态、密度的要求、药效的快慢及持续性等等，一种单剂很难十全十美。为了满足生产实际应用上对制剂速效性、持效性、易用性及低成本等各方面的要求，近年来我国开始了多种生物制剂做成复合剂的研究。四川大学生物工程所采用类产碱假单胞菌（Pseudomonas pseudoalcalingences)与Bt的复合剂防治竹蝗1000公顷，致死率达80%，确保了竹林的生长（葛绍荣等，1999）。广东雷州林业局用日本赤松毛虫质型多角体病毒（J-DsPV5亿PIB/亩）和Bt（500亿芽孢/亩）混合防治马尾松毛虫，6天后死亡率60%，12天达78%，存活虫CPV感染率为81.37%，总防治效果达96.3%（林思诚等，1999），专用CPV和Bt复合剂可迅速降低赤松虫幼虫取食量，提高杀虫效果，处理后5天，复合剂小区幼虫排粪量仅为CPV单用区的2/3—1/2，（陈素伟等，1999），河南森防站使用“菌毒复合型1号”防治马尾松毛虫，35天后虫口减退率86.5%，而单用CPV（2400亿PIB/hm2）为67.4%（裴海潮等，1997)。辽宁昌图县用病毒细菌杀虫剂（V-BtII）防治赤松毛虫，375g/hm27天死亡率达96.8%（梅丽娟等，1998），吉林用GV-Bt复合剂防治杨树分月扇舟蛾可提高防效（于国辉等，1998）。目前生物单剂复配还刚刚开始，有关复配原则、合适的剂型、应用技术及效果评价等，都还有待于深入研究。
5 昆虫病原线虫
昆虫病原线虫寄主范围广，能主动寻找寄主，并且有共生菌，对害虫致病性是两者共同作用的结果，包括它们对寄主血淋巴的破坏，它们产生的毒素和共生菌次级代谢物的杀虫作用而表现为杀虫力高、速度快，尤其对土栖和钻蛀性害虫高效，并对不良条件有一定抵抗力，由于已能人工大量繁殖商品化生产，对环境安全，正在得到推广应用。昆虫病原线虫制剂已占国际生物农药市场销售额的13%，仅次于苏云金杆菌产品。我国自1985的从澳大利亚引进大量离体培养昆虫病原线虫技术以来，已可以在国内生产昆虫病原线虫制剂，虽然还是实验室或中试产品，但已广泛用于多种林业害虫防治，甚至达到一定规模。
5.1 芜菁夜蛾线虫Steinernema fcltiac
在林业上主要用于防治天牛类蛀干害虫。在福建该线虫能寄生麻黄的星天牛（Anoplopora chinensis）中、老龄幼虫、蛹及成虫，处理后4～6天即可使幼虫死亡率达94.4%～100%，在林间对每蛀孔用海绵块塞道施用1万条侵染期线虫，防治效果达90%以上(黄金水等，1997)。在广东同剂量在木麻黄林间施用，星天牛死亡率为86.7%发现在25～30℃致死速度最快，只要虫道内有一定湿度，线虫就能上下运动，4-6天即可将幼虫致死，并在其体内繁殖（刘清浪等，1999），但在四川用于人行道树上的星天牛，致死率仅为64.7%（李树宜等，1994）。在湖北用该线虫防治意杨上的桑天牛（Apriona germari)，每孔注入线虫6000条，死亡率达82.1%（吕昌仁等，1995）。山东室内及林间试验桑天牛、光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）、台湾柄天牛（Aphrodisium sauteri）、黄带星绒天牛（Enbrik-Strandiaunifasciata），也都有较好的敏感性，死亡率较高（刘世儒等，1992；卢希平等，1994）。除天牛外，该线虫用于防治小木蠹蛾（Holcocerus insularis）效果显著，小木蠹幼虫期长达23个月，不同龄期幼虫重叠发生在一个虫道内，由于这种线虫对高低龄幼虫的侵染力没有差异，防治时只要剂量合适，就能兼治各龄幼虫，当线虫剂量为25条/虫时，各龄幼虫死亡率均达92%以上（杨怀文，1989），福建用于防治木麻黄害虫多纹豹蠢蛾、皮暗斑、相思拟木蠢蛾均表现极强侵染力（黄金水，1995）。
5.2 小卷蛾线虫Steinernema carpocapsae
小卷蛾线虫又名蠹蛾线虫，抗干燥能力较强，如CB-16品系干燥处理后存活率仍达85.3%（陈松笔等，1999），因此应用范围较广。在广东和福建用于防治木麻黄星天牛，感染率＞90%(刘清浪等，1999；黄金水等，1997），上海用该线虫A24品系注射法防治悬铃木的星天牛，次晨达61.2%（严巍等，1998），山东泰安用A24品系防治行道树白蜡树上的去斑天牛，用1.8条/孔悬液海绵块塞入蛀孔内泥堵孔口，13天后死亡率达94%。四川用A24在林间喷雾防治鞭角华扁叶蜂幼虫，2天后死亡率68.8%（肖育贵等，1999）。该线虫对白杨透翅蛾（Paranthrne tabaniformis）侵染力也很强，在林间用线虫悬浮液1000条/虫的剂量注入排粪孔，防治效果优于DDYP（潘洪玉等，1997）。在渐江用其防治马尾松的三种害虫天目腮叶蜂（Cephalcia tianmua）、黄缘阿扁叶蜂（Acantholyda Havomarginata）和焦艺夜蛾（Hyssia adusta），均有很强的致病力，15天后死亡率达80%，21天达90～95%，47天达100%（陈汉林，1994）。
5.3 格氏线虫Steinernema glaseri
广东省昆虫所应用格氏线虫KG，NC63和中国商品系防治竹直锥大象（cyrtotrchelrs lingimanrs），把浸染期线虫配制成淀粉糊剂，涂布竹笋的虫蛀口，杀虫率达80%以上，保笋率达50%以上，取得较好的防效（刘南欣，1994）。
5.4 泰山Ⅰ号（异小杆线Heteorhabditis sp）
用泰山I号和芜菁夜蛾线虫在山东泰安杨树及苹果树上，以塞海绵块堵孔法施用10000条/孔的剂量，对4种天牛25天后的死亡率为：光肩星天牛老龄虫90.0%，初龄虫100%，桑天牛75.9%，台湾柄天牛40.0%，黄带黑绒天牛100%（刘世儒等，1992）。福建用泰山I号防治木麻黄的星天牛，以1000条/孔的剂量塞绵块，大面积防效在88%（黄金水，1995）。
上述情况表明，昆虫病原线虫用于防治林木钻蛀性害虫具有很大潜力，但要将其作为常规防治手段，我国还有一些基本技术要建立或健全，如大量培养技术的程序标准化、产品质量快速检测技术、产品的常温贮存技术、优良线虫种的筛选与复壮技术、杀虫谱的拓宽等等（杨怀文，1998）。
综上所述，鉴于森林生态环境相对农田而言较为稳定，生物多样性丰富，林间小气候有利于天敌，定居可能性大，持续效果明显。就天敌之间的关系也常是相辅相成，例如安徽已证实球孢白僵菌、寄蝇和寄生蜂各自独立地共同作用于马尾松毛虫，既不相互增效，也不相互拮抗，其效果是三者的叠加。白僵菌等5种虫生真菌都不侵染松毛虫卵，经高浓度菌液处理后也不影响赤眼蜂的寄生（李增智等，1996）。从林区地广人稀、山陡林密、交通不便，缺乏水源的客观情况看，发展可持续林业，均需大力发展森林害虫的生物防治，随着我国经济的高速发展和生物防治产业化的发展，无疑会促进森林害虫生防的力度和提高生防的质量。